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黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)养殖产量高，是我国重要的水产养殖品种之一，其肉质细嫩、少细刺、味道鲜美，深受人们喜爱[1]，集约化养殖需大量的配合饲料。在高温潮湿的环境中，饲料原料或成品会因加工、运输和存储等管理不当等而滋生霉菌，产生黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)污染[2]，可能会降低黄颡鱼配合饲料的品质，进而影响黄颡鱼的健康养殖。AFT是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，其衍生物约有20多种[3]，其中黄曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1, AFB1)毒性最大，致癌性最强。已有研究发现AFB1在降低其生长[4-6]及繁殖性能[7]、造成机体抗氧化损伤及组织病变的同时[4-6,8]，还能在水产动物组织中蓄积[4]，进而影响水产动物品质。
肝脏是水产动物重要的解毒器官，其结构的完整是机体行使正常生理功能的关键。AFB1被水产动物摄入后，能很快被胃肠道吸收并进入循环系统，在动物各组织中蓄积，还会被转化为AFB1-8,9-环氧化物(AFBO)，以共价键形式与DNA、RNA及蛋白质结合形成加合物，进而损伤肝细胞[2,9]。有研究表明AFB1被水产动物摄食后，不仅会沉积到肝脏组织中，还会损伤水产动物的肝脏结构，造成肝细胞空泡、坏死及细胞核萎缩[4]。黄莹等[10]在异育银鲫(Carassius auratus gibelio)及花鳗鲡(Anguilla marmorata)[11]的研究中发现，水产动物肝脏中AFB1的积累量随AFB1水平的升高而升高。Raghavan等[12]研究发现在杂交鲟(Acipenser ruthenus ♂×A. baeri♀)饲料中添加40 μg/kg的AFB1会造成局部性肝细胞坏死，产生炎症细胞。Zeng等[13]研究发现AFB1会影响凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝脏储存细胞及分泌细胞的数量，造成肝胰腺细胞萎缩等。此外，AFB1还能造成水产动物肝功能损伤，影响机体抗氧化能力及免疫能力，并降低水产动物的抗病能力，研究发现杂交罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)在摄食AFB1饲料后机体免疫能力降低[5]；凡纳滨对虾在摄食AFB1饲料后会引发肝脏氧化应激，造成肝功能受损[14]；越南巴沙鱼(Pangasius hypophthalmus)[15]在摄食AFB1后不仅会使机体肝功能受损，还会降低其抗病能力。但也有研究发现，饲料中添加2 000 μg/kg的AFB1对水产动物肝功能及肝脏组织结构均无显著影响[7,16]。
目前，国内外在AFB1对水产动物毒性机理的研究甚少，已有的研究表明不同水产动物对AFB1敏感程度存在差异[8,15,17-18]，温水性鱼类对AFB1的耐受性较冷水性鱼类更强[2,8,10,12]，且关于AFB1对黄颡鱼影响的研究未见详细报道。因此本实验以黄颡鱼幼鱼为研究对象，研究黄颡鱼配合饲料中添加AFB1对其生长、肠道消化酶及肝脏功能的影响，旨在探明AFB1引发黄颡鱼幼鱼肝脏功能受损的浓度，为黄颡鱼健康养殖提供依据。
HTML
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参照黄颡鱼商品饲料配方，配制一种以鱼粉和豆粕为主要蛋白源，鱼油为脂肪源的基础饲料，在基础饲料中分别添加0、50、100、200 μg/kg的AFB1，配制成含不同AFB1梯度的4种等氮等脂(40.17%蛋白质，6.95%脂肪)实验饲料(表1)。毒素浓度设计梯度参考已有AFB1报道[5,10,18]，添加的AFB1购自美国Sigma公司。饲料原料粉碎后过80目筛，按照配方要求准确称量各种原料，混匀后用饲料制粒机挤压出2.0 mm粒径的颗粒饲料，在阴凉处风干后置于−20 °C冷存备用。其中，AFB1的添加方法按照等比例扩大法，首先将AFB1与少量面粉等比例混合稀释，再按照设计浓度添加到相应饲料中。饲料制作完成后，利用高效液相色谱法检测各组饲料中AFB1的实际值分别为2.13、65.93、102.93、193.98 μg/kg。
项目
item含量
content饲料原料 ingredients 秘鲁蒸汽鱼粉 Peru steam fish meal 360 豆粕 soybean meal 284 面粉 wheat flour 279.6 鱼油 fish oil 34 预混料 premix 25 氯化胆碱 choline chloride 2 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4) 2 15 防霉剂 anti-mildew agent 0.3 抗氧化剂 antioxidant 0.1 合计 total 1 000 营养成分 nutritional composition 粗蛋白质 crude protein 401.7 粗脂肪 crude lipid 69.5 粗灰分 crude ash 77.1 注：预混料为每千克饲料提供碘化钾 (1%) 60 mg、氯化钾 200 mg、六水氯化钴(l%) 50 mg、一水硫酸亚铁400 mg、五水亚硒酸钠(1%) 65 mg、一水硫酸锌 400 mg、五水硫酸铜 30 mg、一水硫酸锰 150 mg、一水硫酸镁 2 000 mg、维生素B1 12 mg、沸石粉 3 645.85 mg、核黄素 12 mg、维生素B6 8 mg、维生素K3 8 mg、维生素B12 0.05 mg、肌醇 100 mg、烟酸 50 mg、泛酸 40 mg、叶酸5 mg、维生素A 25 mg、生物素 0.8 mg、维生素D 35 mg、维生素C 100 mg、维生素E 50 mg、乙氧基喹啉 150 mg、小麦粉 2 434.15 mg
Notes: The premix provided the following per kg diets: KI(1%) 60 mg, KCl 200 mg, CoCl2·6H2O(1%) 50 mg, FeSO4·H2O 400 mg, Na2Se O3·5H2O(1%) 65 mg, ZnSO4·H2O 400 mg, CuSO4·5H2O 30 mg, MnSO4·H2O 150 mg, MgSO4·H2O 2 000 mg, VB1 12 mg, zeolite power 3 645.85 mg, riboflavin 12 mg, VB6 8 mg, VK3 8 mg, VB12 0.05 mg, inositol 100 mg, niacin acid 50 mg, pantothenic acid 40 mg, folic acid 5 mg, VA 25 mg, biotin 0.8 mg, VD 35 mg, VC 100 mg, VE 50 mg, ethoxyquin 150 mg, wheat flour 2 434.15 mgTable 1. Diet formulation and chemical composition of experiment diets
g/kg -
实验用鱼购自湖南某省级良种场，养殖实验在湖南省水产科学研究所进行。实验前期，挑选规格一致的黄颡鱼，通过养殖池(3.0 m×1.5 m×1.0 m)暂养驯化，用对照组饲料驯化2周，饥饿24 h后，挑选初始体质量为(6.00±0.10) g的黄颡鱼600尾，随机分成4组，每组3个重复，共12个养殖池(3.0 m×1.5 m×1.0 m)，每个养殖池放养黄颡鱼50尾。投喂量以黄颡鱼体质量的3%~5%为标准，日投喂 3 次(8:00、12:00、18:00)，每3天调整投喂量。整个养殖实验持续 8周，养殖期间24 h不间断充氧，保持微流水，水温26.0~32.0 °C，溶解氧含量≥6.0 mg/L，氨氮含量≤0.20 mg/L。
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实验开始及结束时记录养殖池黄颡鱼数量和重量，投喂饲料总量等用以计算黄颡鱼的各项生长指标。养殖实验结束后，从每个网箱中随机取5尾黄颡鱼，测定体长、体质量以及内脏、肝脏重量，用以计算黄颡鱼肝体比、脏体比、肥满度。
成活率(survival rate, SR, %)= Nt /N0×100%
增重率(weight gain rate, WGR, %)=(Wt−W0)/W0 ×100%
饲料系数(feed conversion ratio, FCR)=Wf /(Wt−W0)
特定生长率(specific growth rate, SGR, %/d)=(lnWt−lnW0) /t ×100%
肥满度(condition factor, CF, g/cm3)=W/L3×100
肝体比(hepatosomatic index, HSI, %)= Wh/W×100%
脏体比(viscerosomatic index, VSI, %)= Wv/W×100%
式中，Nt为终末尾数；N0为初始尾数；Wt为终末体质量(g)；W0为初始体质量(g)；Wf为摄入饲料量(g)；t为饲喂天数(d)；Wh为鱼肝脏重(g)；Wv为鱼内脏重(g)；W为鱼体质量(g)；L为鱼体长(cm)。
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养殖实验结束后，停食24 h，每个养殖池随机取5尾黄颡鱼，解剖取其整个肠道，去除肠道内容物及其附着物，用冰双蒸水清洗肠道，滤纸吸干，于−80 °C冰箱内保存。测定前，取肠道组织捣碎后加生理盐水1∶9稀释，并放入匀浆仪内进行冰水浴匀浆。匀浆完毕，在4 °C下3 000 r/min 离心15 min，取上清液备用，于24 h内分析完毕。胰蛋白酶(trypsin)、肠道淀粉酶(amylase)和脂肪酶(lipase)活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。
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养殖实验结束后，停食24 h，从每个养殖池中随机取5尾黄颡鱼，经过丁香酚麻醉后，采取尾静脉抽血。采血后，解剖取整个肝脏，滤纸吸干，于−80 °C冰箱内保存。血液在4 °C下静置过夜后，3500 r/min离心15 min，取上清置于−80 °C冰箱备用。黄颡鱼血清葡萄糖(glucose, GLU)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆汁酸(total bile acid, TBA)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)以及肝脏超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondiadehyde, MDA)、AST、ALT等均利用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
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养殖实验结束后，禁食24 h，在每个养殖池中随机选取3尾黄颡鱼，解剖进行肝脏采样，用4%多聚甲醛固定肝组织24 h。常规酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、H.E染色后封片观察，染色剂购自南京建成科技有限公司。观察时每组选取3张非连续性切片，送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行切片扫描，扫描结束后采用Case Viewer图像分析系统分析，每张切片选取同一视野，分别在100倍与200倍下观察黄颡鱼肝脏组织结构，并进行拍照。
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在1.5 mL无酶管中加入1.0 mL Trizol试剂，取30~50 mg在‒80 °C冻存的肝脏组织于无酶管中，用低温匀浆仪进行匀浆处理；匀浆完毕后，室温放置5 min，使肝脏样品充分裂解；在裂解好的样品中加入200 μL氯仿，充分振荡15 s，室温放置2~3 min；将样品12000 r/min，4 °C离心15 min；吸取400 μL上层水相到新的1.5 mL无酶管中，加入400 μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min后，样品12 000 r/min，4 °C离心10 min；弃上清，加入1.0 mL 75%乙醇，小心振荡，洗涤沉淀，然后12 000 r/min，4 °C离心3 min；弃75%乙醇，并重复上步骤；弃75%乙醇，干燥，使管内酒精充分挥发；用30 µL DEPC·H2O溶解沉淀，于‒80 °C存备用。
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cDNA的合成应用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒。cDNA的合成分两步：①基因组DNA的除去反应，反应体系共10 μL(5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,模板RNA 1 μL，RNase Freed H2O 6 μL)，于42 °C孵育2 min；②反转录反应，反应体系共20 μL(5×PrimeScript®Buffer2 4 μL，PrimeSycript®RT Enzyme Mix1 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,反应液10 μL，RNase Freed H2O 4 μL)，于37 °C孵育15 min，并在85 °C下加热5 s合成cDNA模板。
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黄颡鱼肝脏内参基因(β-actin)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, sod)、过氧化氢酶(catalase, cat)、白介素-1β (interleukin-1β，il-1β)、白介素-8(interleukin-8，il-8)、白介素-6(interleukin-6，il-6)、白介素-10 (interleukin-10，il-10)等引物序列见表2。引物设计过程：通过NCBI查找黄颡鱼的基因序列；Primer Premier 5软件设计挑选引物；上海生工有限公司合成引物。Real Time PCR反应体系共12.5 μL (SYBR 6 μL，Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，cDNA 0.5 μL，RNase Freed H2O 5 μL)，实时荧光定量反应程序为95 °C预变性30 s，95 °C变性5 s，55 °C退火25 s，72 °C延伸15 s，共40个循环，最后于70~95 °C下收集数据60 s，荧光定量的结果运用表达量E=2−ΔΔCt方法进行计算，其中ΔΔCt=(Ct目的基因‒Ct内参基因)实验组‒(Ct目的基因‒Ct内参基因)对照组。
目的基因
target gene序列号
accession no.上游引物
forward primer(5′ to 3′)下游引物
reverse primer(5′ to 3′)产物长度/bP
product lengthβ-actin EU161066.1 CTGCTGCCTCTTCCTCCTCT CCGCAGGACTCCATACCC 133 sod KX455916.1 TTGGAGACAATACAAATGGGTG CATCGGAATCGGCAGTCA 129 cat KX455919.1 GAAGTTCTACACCGATGAGGGA ACAGGGTTGCCTTCAGAGTTTA 288 il-1β MF770571.1 AGCGACTGTGGATTTGACTCA CCTGGATACGGATTCCTTTGT 109 il-8 KY218792.1 TGAAGGTCTGCCTGAATCCA GCTTGTTGTTATGTTGACCCTTG 96 il-10 KY218793.1 AGGTTCCTCCTGCTTTCTTTG CTGTTGAATAGTGCGGTGTCC 194 il-6 XM_027176013.1 CTGCACTATCTTGCCCTGTTG TCTGGTCTGGAGCGTGAGC 121 Table 2. Primer sequences used in the study
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实验结果先利用WPS表格进行数据整理，并采用SPSS 19.0对实验数据进行统计分析，实验结果用平均值±标准误(mean±SE)表示。首先对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，如果组间差异显著(P<0.05)，采用Duncan氏进行多重比较。
1.1. 实验饲料
1.2. 饲养管理
1.3. 生长指标的测定
1.4. 肠道消化酶活性测定
1.5. 血清生化指标及肝脏酶活性测定
1.6. 肝脏石蜡组织切片制作与观察
1.7. 肝脏相关基因表达量分析
肝脏组织中总RNA提取
cDNA的合成
实时荧光定量PCR分析基因表达
1.8. 数据处理
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各处理组黄颡鱼幼鱼特定生长率、增重率、饲料系数、成活率、脏体比和肥满度均无显著差异(P>0.05)，但随着AFB1添加量升高，黄颡鱼幼鱼肝体比呈上升趋势，当饲料中AFB1添加量为200 μg/kg时肝体比达到最高且显著高于对照组(P<0.05)(表3)。
项目
itemsAFB1添加量/(μg/kg diet) supplemented AFB1 0 50 100 200 初始均重/g IBW 6.00±0.01 6.01±0.00 5.99±0.00 6.01±0.01 终末均重/g FBW 18.17±0.39 19.82±1.61 18.34±1.33 18.37±1.47 增重率/% WGR 202.70±6.25 229.98±26.92 206.18±22.27 205.66±24.07 特定生长率/(%/d) SGR 1.88±0.04 2.01±0.14 1.89±0.12 1.88±0.14 饲料系数 FCR 2.06±0.10 1.97±0.36 1.97±0.19 1.96±0.24 成活率/% SR 86.00±9.02 85.00±0.58 86.00±3.46 94.00±2.31 肝体比/% HSI 2.06±0.15a 2.38±0.11ab 2.41±0.08ab 2.74±0.13b 脏体比/% VSI 13.13±0.60 11.76±0.53 12.07±0.36 12.01±0.41 肥满度/(g/cm3) CF 0.97±0.01 1.04±0.03 0.97±0.02 1.01±0.02 注：表中同一行数据右上标字母不同表示差异显著，P<0.05；下同
Notes: Data in the same lime with different superscript letters mean significant difference (P<0.05)，the same belowTable 3. Effect of aflatoxin B1 on the growth of juvenile P. fulvidraco
n=3 -
饲料中添加AFB1显著提高了黄颡鱼幼鱼胰蛋白酶活性(P<0.05)，50 μg/kg AFB1添加组胰蛋白酶活性最高。与对照组相比，100 μg/kg和200 μg/kg AFB1添加组肠道淀粉酶和脂肪酶活性显著降低(P<0.05)(表4)。
项目
itemsAFB1添加量/(μg/kg diet) supplemented AFB1 0 50 100 200 胰蛋白酶/(U/mg prot) trypsin 1656.17±48.48a 1906.71±56.02b 1847.09±42.88b 1834.37±29.45b 淀粉酶/(U/mg prot) amylase 58.80±1.51c 54.63±4.70bc 41.82±2.21a 48.02±1.13ab 脂肪酶/(U/g prot) lipase 23.48±1.28b 43.64±1.25c 14.30±1.30a 18.31±2.00a Table 4. Effect of aflatoxin B1 on the digestive enzyme activities in the intestinal tract of juvenile P. fulvidraco
n=3 -
随着饲料中AFB1添加量升高，黄颡鱼幼鱼血清GLU和TG含量呈显著上升趋势(P<0.05)，TC含量在200 μg/kg AFB1添加组显著高于对照组(P<0.05)，其余各处理组间无显著差异。与对照组相比，AFB1添加组血清AST与ALT活性显著升高(P<0.05)，100 μg/kg AFB1添加组血清TBA含量显著高于其他各组(P<0.05)(表5)。
项目
itemsAFB1添加量/(μg/kg diet) supplemented AFB1 0 50 100 200 葡萄糖/(mg/dL) GLU 108.72±0.96a 120.72±2.41b 157.16±3.15c 226.84±2.49d 总胆固醇/(mmol/L) T-CHO 5.50±0.15a 5.62±0.14ab 5.69±0.05ab 5.93±0.05b 甘油三酯/(mmol/L) TG 2.62±0.04a 2.77±0.02b 4.07±0.05d 3.29±0.08c 总胆汁酸/(μmol/L) TBA 11.33±0.55a 11.50±0.54ab 13.42±0.55c 13.12±0.67bc 谷丙转氨酶/(U/L) ALT 4.88±0.33a 7.95±0.25b 7.36±0.86b 18.70±1.26c 谷草转氨酶/(U/L) AST 23.93±1.68a 34.38±2.35b 33.24±0.63b 43.08±2.06c Table 5. Effect of aflatoxin B1 on serum biochemical indexes of juvenile P. fulvidraco
n=3 -
饲料中AFB1含量低于50 μg/kg对黄颡鱼幼鱼肝脏AST、ALT活性无影响，当AFB1浓度达100 μg/kg时，黄颡鱼幼鱼肝脏AST活性(图1-a)显著下降(P<0.05)，而肝脏ALT活性(图1-b)则在AFB1浓度达200 μg/kg时显著下降(P<0.05)。
Figure 1. Effect of aflatoxin B1 on activities of AST, ALT in liver of juvenile P. fulvidraco
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经含AFB1的饲料投喂56 d后，各实验组黄颡鱼幼鱼出现绿肝现象。肝脏组织学(图版)观察可知，50 μg/kg组与对照组相比无明显影响，而当AFB1浓度达200 μg/kg，黄颡鱼幼鱼部分肝细胞出现轻微萎缩、肝细胞核移位、细胞界限模糊、肝细胞内空泡化程度增加。
Figure 图版. Effect of aflatoxin B1 on liver tissue structure of juvenile P.fulvidraco
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随着AFB1添加量的升高，黄颡鱼幼鱼肝脏CAT活力和MDA含量显著升高(P<0.05)。当AFB1添加量达100 μg/kg时，黄颡鱼幼鱼肝脏SOD活性显著升高(P<0.05)，其余各组间无显著差异(P>0.05)(表6)。黄颡鱼幼鱼肝脏sod (图2-a)基因表达量会着随AFB1浓度上升显著上调(P<0.05)，cat(图2-b)基因表达量则在200 μg/kg AFB1组显著上调(P<0.05)。
项目
itemsAFB1添加量/(μg/kg diet) supplemented AFB1 0 50 100 200 过氧化氢酶/(U/mg) CAT 9.46±1.67a 13.65±0.38b 15.51±1.95b 19.42±0.56c 超氧化物歧化酶/(U/mg) SOD 151.62±14.51ab 137.18±10.11a 167.51±7.57bc 193.20±4.59c 丙二醛/(nmol/mg) MDA 8.31±0.45a 10.97±0.61b 18.06±0.99c 26.03±1.31d Table 6. Effect of aflatoxin B1 on the antioxidant indexes in the liver of juvenile P. fulvidraco
n=3 
Figure 2. Effect of aflatoxin B1 on liver antioxidant related gene expression of juvenile P. fulvidraco
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随着AFB1浓度的升高，il-1β (图3-a)基因表达量显著上调(P<0.05)，当AFB1水平达200 μg/kg时，il-8 (图3-b)基因及il-10 (图3-c)表达量出现显著上调(P<0.05)，而各毒素组il-6 (图3-d)基因表达量与对照组无显著差异(P>0.05)。
Figure 3. Effect of aflatoxin B1 on liver inflammatory related gene expression of juvenile P. fulvidraco
2.1. AFB1对黄颡鱼幼鱼生长性能的影响
2.2. AFB1对黄颡鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响
2.3. AFB1对黄颡鱼幼鱼血清生化指标的影响
2.4. AFB1对黄颡鱼幼鱼肝脏AST，ALT活性的影响
2.5. AFB1对黄颡鱼幼鱼肝脏组织形态结构的影响
2.6. AFB1对黄颡鱼幼鱼肝脏抗氧化能力的影响
2.7. AFB1对黄颡鱼幼鱼肝脏炎症相关基因表达的影响
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AFB1是一种剧毒物质，高剂量AFB1易造成机体死亡，低剂量AFB1会因累积效应导致机体慢性中毒，阻碍生长发育及其对营养物质的吸收[19]，造成水产动物体表黄化、生长下降、行为异常等[2]。研究发现，杂交鲟[12]摄食80 μg/kg AFB1饲料25 d后存活率显著下降，巴沙鱼[15]、喀拉鲃(Catla catla)[20]摄食50 μg/kg AFB1饲料后增重率显著降低。然而，在本实验研究发现黄颡鱼幼鱼摄食200 μg/kg AFB1饲料56 d后其生长性能与对照组无明显差异，这与黄莹等[10]研究结果类似，造成这些不同结果的可能原因有：养殖时间短，低剂量累积效应不足以阻碍动物的生长发育；添加AFB1的浓度和方法不同；不同品种或不同阶段水产动物对AFB1生物转化能力有差异等。与此同时，本实验中的饲料系数相对偏高，推测其原因是养殖用水为池塘水，能见度较低，实验所用饲料为沉性料，在投喂时易造成浪费。
肠道是消化吸收的主要器官，摄食AFB1会引发肠道氧化应激，导致肠道屏障功能受损，从而降低动物的生长性能[19,21]。冯光德等[22]发现肉鸭摄食霉变玉米(含AFB1)后胰淀粉酶、脂肪酶活性无明显影响；Han等[23]发现，饲喂20或40 μg/kg AFB1饲粮时，肉鸭十二指肠内食糜中胰蛋白酶和淀粉酶活性增加。而在本实验中，AFB1浓度达100 μg/kg时，淀粉酶、脂肪酶活性显著下降，这表明适量的AFB1不会对黄颡鱼幼鱼脂肪、糖类等的消化造成影响，但饲料中AFB1浓度过高会加重肠道的负担，从而对淀粉酶、脂肪酶的分泌造成影响。胰蛋白酶一般是以酶原的形式通过胰腺细胞分泌，当动物肠道黏膜屏障损伤时，胰蛋白酶会侵入肠壁，导致胰蛋白酶活性升高[24]，实验中AFB1浓度升高，黄颡鱼幼鱼胰腺等发生慢性炎症，胰腺细胞大量释放酶原，使得黄颡鱼幼鱼肠道内的胰蛋白酶活性异常升高，肠道对营养物质的消化吸收能力并未加强。
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肝脏是AFB1的主要靶器官，AFB1的毒性作用表现：动物在摄食AFB1饲料后，饲料中的AFB1在机体内通过细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450, CYP450)代谢为AFBO，随后以共价键形式与DNA、RNA及蛋白质结合形成加合物[2,9]，损伤肝细胞。而肝脏是葡萄糖、脂肪和蛋白质代谢的重要场所。血清甘油三酯、胆固醇能够反映出机体对脂类代谢状况[25]，当机体脂质代谢与葡萄糖代谢出现紊乱时，血清葡萄糖、甘油三酯、胆固醇含量升高。转氨酶主要存在于肝细胞胞浆内，参与蛋白质的代谢，催化氨基酸与酮酸之间氨基的转移，ALT活性升高表明机体氨基酸代谢旺盛，合成代谢增强，蛋白质分解减弱，有利于氮的沉积，AST活性升高则表明尿素生成速度加快，氨基酸代谢产物的毒害作用削弱，两者的活性高低可反映机体蛋白质合成及分解的情况[26]，当细胞受损时转氨酶可逸出细胞外，导致血清中ALT和AST活性升高，血清中两者的活性常作为反映肝细胞受损的主要敏感指标。本实验中，黄颡鱼摄食AFB1饲料后，血清中GLU、TG、TC和TBA含量以及AST和ALT活性升高，肝脏中AST和ALT活性降低，表明AFB1进入黄颡鱼幼鱼机体后，形成的加合物会造成黄颡幼鱼葡萄糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，肝脏功能受损。本研究结果与在凡纳滨对虾[13]、巴沙鱼[15]、异育银鲫[27]上的研究一致，而在草鱼(Ctenopharyngodon idella)[16]上的研究却发现摄食AFB1含量≤500 μg/kg饲料56 d后AST、ALT无显著变化，未造成肝功能受损，说明不同水产动物对AFB1耐受程度存在差异，但具体机制还需进一步研究。
肝脏是鱼类最主要的解毒器官，可将体内新陈代谢产生的有毒物质化解成为无毒，毒性较轻或容易被溶解的物质，再经胆汁或尿液排出体外，肝脏结构完整是其行使正常生理功能的重要保障。本实验中，随着饲料中AFB1浓度的上升，黄颡鱼幼鱼机体内形成的加合物逐渐增多，肝脏的解毒作用不足以抵消AFB1的毒性作用，导致鱼体肝体比逐渐增大，部分肝细胞出现轻微萎缩、肝细胞核移位、细胞界限模糊、肝细胞内空泡化程度增加，肝细胞结构受损。有研究发现，罗非鱼摄食超过245 μg/kg AFB1饲料20周以上后会导致肝形态异常，肝脏空泡化严重[5]；凡纳滨对虾摄入AFB1(400~2 000 μg/kg)后肝细胞坏死程度加深，肝胰腺空泡数量增加[28]，与本实验结果相似，推测AFB1造成肝脏葡萄糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱及肝功能破坏可能与肝脏形态损伤有关。
SOD、CAT作为抗氧化系统中的重要指标，在维持机体氧化与抗氧化平衡中起关键作用，两者可在一定程度上反映机体抗氧化能力[29]，MDA作为自由基引发脂质过氧化反应后的最终分解产物，其含量不仅能反映机体脂质过氧化程度，还能反映机体细胞损伤程度[30]。本研究中，随着AFB1浓度的升高，黄颡鱼幼鱼肝脏CAT、SOD活性、MDA含量均呈现升高趋势，sod、cat基因表达量也出现显著上调，这与凡纳滨对虾摄食15 mg/kg AFB1后SOD、CAT、GST活性增加类似[31]，推测可能是由于AFB1浓度增加，毒性增强，肝脏损伤，产生氧化应激反应，机体生理失衡。白细胞介素(il)是由淋巴细胞等产生的细胞因子，在免疫反应、造血以及炎症过程中起着调节作用。其中，il-6可通过诱导B细胞的产生和T细胞增殖和分化来参与机体的免疫应答[32]，il-8能促进炎症细胞趋化和诱导细胞增殖，il-1β作为早期促炎症的关键细胞因子，不仅能调节机体免疫反应，还能在细菌感染时诱导一系列炎症反应[33]，而il-10则具有抗炎特性，能减少促炎介质的产生，也能抑制抗原呈递[34]。有研究表明，AFB1能诱发机体炎症反应[32]，与本实验研究结果相似，随着饲料中AFB1水平的升高，黄颡鱼幼鱼肝脏促炎症因子il-1β、il-8表达量以及抗炎因子il-10表达量显著上调，说明饲料中添加AFB1诱发了黄颡鱼幼鱼肝脏炎症反应。
3.1. AFB1对黄颡鱼幼鱼生长和肠道消化酶活性的影响
3.2. AFB1对黄颡鱼幼鱼肝脏功能的影响
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在本实验条件下，饲料中AFB1含量低于200 μg/kg不影响黄颡鱼幼鱼生长性能，但饲料中AFB1≥50 μg/kg时会影响黄颡鱼幼鱼肠道的消化吸收功能，同时引起肝脏氧化应激及炎性反应，造成肝脏功能损伤。
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