• ISSN 1000-0615
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Characteristics of formation related genes (PyMFG) of monospores and analysis of differential expression in Pyropia yezoensis

  • Corresponding author: YAN Xinghong, xhyan@shou.edu.cn
  • Received Date: 2019-03-26
    Accepted Date: 2019-05-28
    Available Online: 2020-06-16
  • In our study, a complete open reading frame of PyMFG was obtained by RT-PCR based on the sequence of differentially expressed genes (Contig-21827) screened by transcriptome sequencing of Pyropia yezoensis. Sequence analysis showed that the ORF of the PyMFG was 1 224 bp in length and encoded a polypeptide fragment of 407 amino acids with a molecular weight of 46.24 ku, and theoretical pI of 9.08. Domain analysis revealed that the protein contains a conserved TEA domain and a YAP domain, which belongs to the TEA-ATTS superfamily domain. We found that the protein and fungal conidia forming proteins clustered into one large branch with close genetic relationship through multiple sequence alignment and phylogenetic analysis. In addition, the comparison of the ability of releasing monospores and qRT-PCR analysis between different strains indicated that the expression trend of PyMFG in PY26W and PY26W' was highly consistent with macroscopic statistical results, while the trend in PY26R and PY26R' were exactly existed difference. By inference, the gene type and molecular mechanism regulating the formation and release of monospores in the parental (PY26W) and partial parental strain (PY26W') and the female parental (PY26R) as well as partial female strain (PY26R') existed certain difference, leading to the divergence between the macroscopic statistical results of monospores and the qRT-PCR results.
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  • Relative Articles

    [1] HUANG Linbin, YAN Xinghong. Genetic analysis of major economic traits in Pyropia yezoensis using double haploid population. Journal of fisheries of china,  doi: 10.11964/jfc.20161210641
    [2] WU Hanghang, DING Hongchang, YAN Xinghong. Selection and characterization of a high-temperature resistant strain by hybridization recombination in Pyropia yezoensis. Journal of fisheries of china,  doi: 10.11964/jfc.20161010577
    [3] HUANG Linbin, HUANG Wen, YAN Xinghong. Low-salinity tolerance of two high-temperature resistant strains in Pyropia yezoensis. Journal of fisheries of china,  doi: 10.11964/jfc.20190311687
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Characteristics of formation related genes (PyMFG) of monospores and analysis of differential expression in Pyropia yezoensis

    Corresponding author: YAN Xinghong, xhyan@shou.edu.cn
  • 1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China
  • 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
  • 3. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

Abstract: In our study, a complete open reading frame of PyMFG was obtained by RT-PCR based on the sequence of differentially expressed genes (Contig-21827) screened by transcriptome sequencing of Pyropia yezoensis. Sequence analysis showed that the ORF of the PyMFG was 1 224 bp in length and encoded a polypeptide fragment of 407 amino acids with a molecular weight of 46.24 ku, and theoretical pI of 9.08. Domain analysis revealed that the protein contains a conserved TEA domain and a YAP domain, which belongs to the TEA-ATTS superfamily domain. We found that the protein and fungal conidia forming proteins clustered into one large branch with close genetic relationship through multiple sequence alignment and phylogenetic analysis. In addition, the comparison of the ability of releasing monospores and qRT-PCR analysis between different strains indicated that the expression trend of PyMFG in PY26W and PY26W' was highly consistent with macroscopic statistical results, while the trend in PY26R and PY26R' were exactly existed difference. By inference, the gene type and molecular mechanism regulating the formation and release of monospores in the parental (PY26W) and partial parental strain (PY26W') and the female parental (PY26R) as well as partial female strain (PY26R') existed certain difference, leading to the divergence between the macroscopic statistical results of monospores and the qRT-PCR results.

  • 条斑紫菜隶属于红藻门(Rhodophyta)、原红藻纲(Protoflorideae)、红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜属(Pyropia)[1]。主要分布于中国黄海、渤海和东海北部沿岸以及日本和朝鲜半岛,是中、日、韩三国共有的紫菜种类,其产业在中国及世界海藻产业中占有重要的经济地位[1]。条斑紫菜利用丝状孢子体和叶状配子体完成世代交替,此外,其可通过放散单孢子的形式进行无性生殖,为海区生产提供了大量次级苗源[2]。现有研究表明,Pyropia属红藻单孢子的形成与放散一定程度上影响了藻体的大小与数量,最终决定了其产量[3]

    目前研究表明,温度、光照、营养盐、海水密度等培养条件的改变均可影响单孢子的形成与放散[4-7]。此外,尿囊素、硫酸铵等外源物质的添加对单孢子的放散亦具有重大影响 [6, 8-9]。早期研究发现,甲基硝基亚硝基胍(MNNG)可诱导野生型的条斑紫菜U-511产生大量放散单孢子的色彩突变体[2]。然而,近年来,随着紫菜诱变育种技术的不断深入,学者们利用60Co γ射线对大量放散单孢子的印度产紫菜(P. chauhanii)野生型品系(PC-WT)进行诱变,进而分离出不放散单孢子且经过数代培养后可稳定遗传的印度产紫菜PC-Y1品系[10],这表明单孢子的形成和放散是由基因决定的。此外,条斑紫菜的营养细胞在特化为单孢子的过程中,单孢子细胞的cDNA电泳条带明显减少,说明其遗传信息的表达发生了明显变化[11]。Kitade等[12]认为,营养细胞在特化为单孢子时,参与卡尔文循环的差异基因显著性表达;此外,孙迪等[8]证实培养液中外源尿囊素的添加亦可促进单孢子的大量放散。以上结果说明,单孢子的形成和放散与能量、嘌呤代谢通路密切相关。

    本研究通过对条斑紫菜转录组数据库进行同源性搜索和基因注释查找,筛选到一条与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)分生孢子形成基因(abaA)(GenBank登录号:AN0422.2)的同源序列(Contig-21827),二者编码的氨基酸序列同源性为54.22%。经研究证实:构巢曲霉的分生孢子是借由特化的分生孢子梗经有丝分裂发育而来,新分裂出的单倍体个体与母细胞具有相同的基因型,成熟释放至合适环境中能发育为两个独立的真菌个体;紫菜属的单孢子是由配子体上的营养细胞经有丝分裂特化发育而来,新的单孢子苗携带的遗传信息与营养细胞完全相同且游离的单孢子可以独立发育成完整植株。由此可见,条斑紫菜单孢子形成与子囊菌门(Ascomycota)真菌分生孢子的产生极为相似。本实验类比构巢曲霉分生孢子形成通路和二者的遗传模式进一步分析,发现该基因与条斑紫菜单孢子的形成相关性极大,将其命名为PyMFG

    本研究旨在通过RT-PCR技术克隆得到PyMFG基因的ORF全长并对其进行一系列生物信息学分析,以期为进一步开展条斑紫菜在工程菌中的表达研究与开发合理放散单孢子的紫菜新品种奠定基础。

1.   材料与方法
  • 本实验所用的条斑紫菜为4个杂交重组品系(PY26WPY26W'PY26RPY26R'),由其野生型品系(U-511,父本)与大量放散单孢子的红色突变体(fre-1,母本)杂交产生的色块分离纯化而来,突变体的获得方法详见Yan等[2],分离纯化方法同刘美君等[13],以上品系在文中简称为WW'RR'。各品系以自由丝状体的形式被保存于实验室中,保存方法同Kato等[14]。丝状体促熟后,刺激其放散壳孢子作为后续实验材料。叶状体的培养条件:(19±1) °C,40 μmol photons/(m2·s),10 L∶14 D,每5天更换1/2的培养液。培养液为添加MES培养基、比重为1.020的灭菌海水。取以上品系培养至日龄为25、30、35 d时的叶状体,用蒸馏水清洗干净后置于液氮中速冻3~5 min,最后保存至-80 °C冰箱备用。此外,收取日龄35 d的野生型圆紫菜(PS-WT)、印度产紫菜(PC-WT)、坛紫菜(P. haitanensisWT-8)用做荧光定量PCR验证的材料,其培养温度为(23±1) °C,其他培养条件同上。

  • 将条斑紫菜4个重组品系(WW'RR')的壳孢子培养至日龄为20 d时,分别挑选3组大小一致、长势相同的30棵叶状体用作后续实验。首先,每组叶状体置于白色塑料杯中充气培养,翌日用灭菌的镊子取出并放置于盛有新鲜培养液的新塑料杯中继续培养。旧塑料杯中的单孢子置于其合适的生长条件下,待其肉眼可见时,用灭菌毛笔刷下并统计各品系每株叶状体的单孢子日放散量,连续统计15 d后获得单孢子总放散量,以此确定条斑紫菜不同品系的单孢子放散能力。

  • 采用Trizol试剂法[15]提取条斑紫菜不同品系的叶状体总RNA。首先,取0.1~0.3 g紫菜叶状体,液氮迅速研磨后转入含有1 mL Trizol试剂(Ivitrogen公司)的除酶离心管中。4 °C,12 000×g离心10 min后,向上清液中加入200 μL氯仿抽提,然后经4 °C,12 000×g离心10 min,再次吸取上清液并加入等体积异丙醇离心获得RNA沉淀。然后加入1 mL 75%的乙醇(DEPC水配)洗涤沉淀2次,最后在超净工作台中风干5 min,用适量无RNase水溶解RNA。取1 μg RNA反转录合成cDNA,以此为模板进行后续实验。Trizol试剂购自Ivitrogen公司,反转录试剂盒购自TaKaRa公司,其他药品均为进口分装或国产分析纯。

  • 本研究通过对条斑紫菜转录组数据进行同源性搜索和基因注释查找,筛选到一条长1 314 bp的单孢子形成相关基因PyMFG。利用ORF Finder (HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/htaml)在线预测该基因的ORF区后,采用NCBI Primer Blast在其ORF区分别设计上、下游引物PyMFG F、PyMFG R,引物序列详见表1

    引物名称
    primer names
    序列(5′-3′)
    sequence (5′-3′)
    退火温度/°C
    annealing
    PyMFG F ATGGCTGAGGATCAAAGTG 55.0
    PyMFG R TTATTGTGTACTTGGAGAAAACAT 56.0
    PH18S F GTCCAGAGCGCTTTGAGATG 59.8
    PH18S R AACCCTAATTCCCCGTCACC 59.8
    PyMFG qRT-F CAGAAGAACACATTGCAGAACGA 60.0
    PyMFG qRT-R GTGATGGTAAACCTGCAACGG 61.0

    Table 1.  Primers of ORF verification of PyMFG and qRT-PCR

    25 μL PCR反应体系为Premix rTaq 酶12.5 μL,模板1 μL,无RNase 水10.5 μL,上、下游引物各0.5 μL。程序设置为94 °C预变性5 min,94 °C变性30 s,60 °C退火30 s,72 °C延伸2 min,最后72 °C延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测、胶回收纯化(南京诺唯赞)后与pMD-19T载体连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序引物为M13通用引物。Premix rTaq酶、无RNase水、载体、感受态细胞均购于TaKaRa公司,LB培养基购于上海生工生物工程技术服务有限公司。

  • 根据ORF Finder预测PyMFG的开放阅读框(open reading frame, ORF),获取其编码蛋白的氨基酸序列。应用在线分析工具(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析蛋白质的组成、疏水性、分子量和等电点。应用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)对PyMFG的二级结构进行预测。应用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质的跨膜区进行预测。应用PROSITE数据库(https://prosite.expasy.org/)对蛋白质序列的功能位点进行预测;应用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)进行结构域分析。应用TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测该蛋白在胞内的位置。应用NCBI Blastp搜索获得PyMFG所编码氨基酸的同源序列并用Bioedit软件进行同源性分析。应用 MEGA 7.0软件根据邻近法(Neighbor Joining)和最大似然法(Maxmiun Likehood)构建系统发育进化树。

  • 将条斑紫菜PyMFG蛋白序列提交至Swiss-Model进行建模,得到条斑紫菜PyMFG 蛋白的3D结构模板4ln0。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载4ln0单体结构,使用Pymol软件将预测的PyMFG结构与数据库中的4ln0单体结构进行拟合,模拟PyMFG中相应氨基酸的空间位置。

  • 根据已经得到的cDNA序列,利用NCBI Primer Blast在线设计荧光定量PCR的上、下游引物PyMFG qRT-F和PyMFG qRT-R(表1)。根据坛紫菜18S rRNA序列设计上、下游引物PH18S F和PH18S R(表1),利用Bio-Rad CFX-96以及SYBR I荧光染料(TaKaRa)完成荧光定量PCR实时检测,程序设置同Koramutla等[16]。首先将该基因进行紫菜种间验证(PY26W'、PS-WT、PC-WT、WT-8);而后在条斑紫菜PY26品系内(WW'RR')进行品系间验证。不同品种的不同日龄组间分别设置3个生物学重复,每个生物学重复设置3个平行副孔,以PH18S作为内参基因,W品系作为对照组,按照2−△△Ct法计算基因的相对表达量。定量结果为平均值±标准差,应用Origin 8.5软件对实验数据进行统计分析,并采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异,P<0.05表示差异显著。

2.   结果
  • 1%的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,PyMFG基因的开放阅读框全长1 224 bp。其编码的氨基酸序列如图2所示,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA。

    Figure 1.  Electrophoresis patterns of amplified products of whole length of ORF about PyMFG in P. yezoensis

    Figure 2.  Full-length of amino acid sequence encoded by PyMFG gene in P. yezoensis

  • 条斑紫菜PyMFG蛋白的特性分析结果如表2所示,该蛋白的分子量为46.24 ku,等电点为9.08,分子式为C2 064H3 257N559O616S15。此外,该蛋白含有较多的丝氨酸与大量疏水性氨基酸。其中,Ile占9.1%、Pro占7.4%、Leu占6.4%、Phe占4.7%、Val占4.2%、Tyr占3.7%、Met占2.2%、Trp占0.5%,总体约占氨基酸总数的42.4%。分析发现,该蛋白为细胞核蛋白,不稳定且具有较强的亲水性。

    选项
    options
    参数
    parameters
    分子量 formular weight 46.24 ku
    等电点 isoelectric point 9.08
    带负电荷残基总数
    total number of negatively charged residues
    40
    带正电荷残基总数
    total number of positively charged residues
    49
    不稳定指数 index of instability 63.64
    脂肪族指数 aliphatic index 76.66
    亲水性平均值 average hydrophilicity −0.483
    亚细胞定位 subcellular localization 细胞核
    信号肽 signal peptide
    跨膜区 transmembrane domain

    Table 2.  Physical and chemical properties of PyMFG of P. yezoensis

    条斑紫菜PyMFG蛋白的跨膜区分析结果如表2所示,该蛋白无明显的跨膜α螺旋和信号肽。其二级结构主要由13.02%的α螺旋,14.25%的β-折叠以及72.73%的卷曲构成。同时,该蛋白含有2种、4个多功能位点,分别是长度为1的第28位的多核苷酸结合位点和长度依次为1、3、2的第35~36、321~323、369~370位氨基酸结合位点。

    条斑紫菜PyMFG蛋白的结构域预测结果如图3所示,该蛋白含有TEA结合结构域和YAP结合结构域,分别位于ORF的Met1~Arg77区间和Glu143~Glu282区间,属于TEA-ATTS超家族结构域。

    Figure 3.  Amino acid hydrophobicity analysis of PyMFG in P. yezoensis

    利用Swiss-Model和Pymol对条斑紫菜单孢子形成蛋白(PyMFG)空间结构,预测该蛋白由3个α螺旋(H1/H2/H3)、9个β折叠片层以及10个环状连接组成,且TEA结合结构域位于H1螺旋的表面(图4)。

    Figure 4.  Simulated three-dimensional structure of PyMFG of P. yezoensis

  • 条斑紫菜的PyMFG基因与NCBI登录的部分产孢物种的孢子形成基因编码的氨基酸多序列比对结果如图5所示,条斑紫菜的PyMFG基因编码的蛋白具有保守的Trp、Ser、Glu、Gln、Ala、Leu、Ile、Gly、Arg、Asn、Val、His。此外,在其编码的第8~46位氨基酸和第62~73位氨基酸处存在2个保守区域,前者以保守的Gly和Glu为主,后者以保守的Arg、Val、Ser、Gln为主。进一步分析发现,该蛋白的2段氨基酸保守区域均位于TEA结合结构域位置。

    Figure 5.  Alignment of homologous amino acid sequence of PyMFG between different species

    为进一步明确条斑紫菜的进化情况,本研究以条斑紫菜PyMFG蛋白为基础,从GenBank登录的不同真菌和细菌物种中筛选出13个与孢子萌发、形成有关的蛋白进行氨基酸序列比对,构建的系统发育进化树如图6所示,条斑紫菜PyMFG蛋白并未独立于真菌分生孢子形成蛋白的亚分支,而是与构巢曲霉、黑曲霉(A. luchuensis)聚为小支后再与葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)等子囊菌门(Ascomycota)的真菌聚为一个大的亚支,Bootstrap值较大。更重要的是,条斑紫菜并未直接与细菌的不同物种相聚。

    Figure 6.  Phylogenetic tree analysis of PyMFG in different species

  • PyMFG基因在紫菜种间的荧光定量分析结果如图7所示。该基因在不放散单孢子的野生型坛紫菜(WT-8)中不表达,在大量放散单孢子的野生型圆紫菜(PS-WT)、印度产紫菜(PC-WT)以及条斑紫菜(W')中能够表达且种间的表达量差异显著。

    Figure 7.  Comparison of relative expression of PyMFG in different species of P. yezoensis

    PyMFG基因在条斑紫菜不同品系间的荧光定量分析结果如图8所示,该基因在W品系中不表达;在RR'品系中的表达量相对较低;然而,该基因在W'品系中大量表达且与相同日龄的WRR'品系中的表达量差异显著。

    Figure 8.  Comparison of relative expression of PyMFG in different strains of P. yezoensis

    PyMFG基因在条斑紫菜不同品系不同日龄时的荧光定量分析结果如图9所示,PyMFG基因在日龄为25、30、35 d的W品系中不表达;在W'品系中随着藻体日龄的增长,表达量相应增大;然而,在RR'品系中的表达量相对较低。

    Figure 9.  Comparison of relative expression of PyMFG in different culture days of different strains in P. yezoensis.

  • 条斑紫菜4个杂交重组品系(WW'RR')在日龄为20~35 d时每株叶状体的单孢子放散总量如图10所示。W品系在15 d内不放散单孢子,RW'R'品系每株叶状体的单孢子放散数量较大且RR'的放散量与WW'品系具有显著性差异。

    Figure 10.  Comparison of total numbers of released monospores of per blade in different strains of P. yezoensis

3.   讨论
  • 通过对PyMFG基因编码的氨基酸序列分析发现,该基因编码的蛋白质含有TEA和YAP结构域,属于TEA-ATTS超家族。该蛋白结构域家族发现于转录增强因子(TEF)和分生孢子发育调节因子aba中,位于真核转录因子的氨基末端。研究发现,TEAD转录因子家族是发育过程所必需的,其家族成员含有与DNA元件结合的TEA结构域和与转录共激活因子相互作用的反式激活结构域,与传递下游信号息息相关。研究表明,TEAD1可参与上皮细胞的调节分化和上皮形态发生[17]。此外,亦有研究指出,TEAD可结合更具亲和力的TEF-1和TEC1位点,通过磷酸化一种或多种DNA结合表面的丝氨酸(Ser-65,Ser-66和Ser-76),引入静电排斥或空间位阻,干扰与DNA的结合,进而调节TEA/ATTS转录因子活性[18],从而激起下游信号的应答。

    研究证实,TEA-ATTS超家族结构域中的TEF与其同源蛋白具有高度保守的真核DNA结合位点,与病毒基因的转录密切相关[19]。TEF-1可以通过N末端的TEAD结合M-CAT原件调节心脏、骨骼和平滑肌的发育,且L1环是TEAD协同加载到串联重复的M-CAT DNA结合位点时必需的[18]。研究发现,哺乳动物中存在4种高度保守的TEAD/TEF转录增强因子(TEAD1-TEAD4),需要转录共激活因子的结合才可以激活DNA的转录调控反应[20-21]。除TEF-1外,该家族结构域包含参与Ty1反转录转座子激活过程的酵母蛋白TEC1[20, 22]、控制构巢曲霉分生孢子发育末期反馈调控回路的AbaA蛋白以及调控果蝇自身的发育分化和神经系统中某些特定基因表达的SD蛋白[23-25]。目前研究发现,条斑紫菜单孢子形成过程与子囊菌门真菌分生孢子的形成过程极为相似。更重要的是,已有研究证实,TEA结构域家族发现于转录增强因子(TEF)和分生孢子发育调节因子aba中,且构巢曲霉abaA基因的特异性表达能够促使其产生分生孢子头和维持分生孢子产量[26-28]。由此推断,PyMFG蛋白的TEA结构域与条斑紫菜单孢子形成相关基因的转录密切相关。

    TEAD包含N末端的DNA结合结构域和C末端的YAP效应结构域,与细胞的发育分化过程密不可分[18, 29]。研究表明,YAP是Hippo途径的末端效应物之一,是参与核心激酶盒的最关键步骤,其主要作用于诱导增殖促进和抗凋亡基因的表达[30-31]。然而,Hippo途径的主要功能是抑制增殖和促进细胞凋亡,从而限制器官的过度生长[32]。研究发现,黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的Hippo途径敲除后导致细胞无限分裂[33]。此外,Hippo途径还可以通过磷酸化和激活细胞质的YAP来抑制YAP-TEAD杂合转录因子发挥作用[29]。更重要的是,在缺乏或阻断 Hippo 信号转导的情况下,未磷酸化的YAP可以进入细胞核作为转录共激活因子,结合并激活TEA家族转录因子 TEAD或SD,进而调控下游靶基因的转录。由此推断,YAP对TEA具有激活、促进作用,猜测二者在条斑紫菜PyMFG蛋白中亦具有相似功能,可能与激活单孢子形成相关基因的转录表达密切相关。

  • 多序列比对结果显示,条斑紫菜的PyMFG基因所编码的蛋白与子囊菌门的构巢曲霉、黑曲霉、葡萄孢菌、酿酒酵母、假丝酵母等分生孢子形成蛋白具有多种相同的保守氨基酸,且Gly、Glu、Arg、Val、Ser、Gln的使用频率较高。然而,所有参与同源序列比对的物种中并未存在一种使用频率更高的保守氨基酸。由此推测,无论是子囊菌门的分生孢子还是条斑紫菜的单孢子,其发育分化过程均需要多种必需氨基酸的共同参与,进化水平较低。

    此外,系统发育分析结果显示,条斑紫菜与构巢曲霉和黑曲霉聚为一个小的亚支,充分说明PyMFG基因与其分生孢子形成基因abaA在调控孢子形成方面的保守性,亲缘关系密切。然而,条斑紫菜与细菌聚为的分支呈现极低的Bootstrap值,说明该蛋白与细菌的亲缘关系较远,两物种的孢子形成过程具有较大差异。

    目前,关于藻类与真菌的起源进化主要存在两种理论。一种为起源多源论,认为藻类由于色素体的丧失,逐渐由自养生活变为异养生活,从而使自身演变为真菌。另一种为鞭毛生物起源论,认为藻类和真菌起源于同一种单细胞原始水生鞭毛生物,其鞭毛数量不一,个体间叶绿素和其他色素有无、含量方面均存在差异。因此,随着进化时间的推移,本身具有色素的个体演化为藻类,而不具有色素的个体演化为真菌[34]。综上所述,本研究得出的条斑紫菜单孢子形成基因(PyMFG)编码的蛋白与构巢曲霉、黑曲霉等子囊真菌分生孢子形成蛋白亲缘关系更近的结果较为合理,为后续研究单孢子形成与放散的分子生物学机制提供了方向和理论支持。

  • 培养观察发现,单孢子的形成与放散是一个连续的过程,其形成或放散并不能以单一生物学过程独立存在于其无性生殖过程中。单孢子最终放散的数量与速率取决于其形成的数量与速率,单孢子在不形成时亦不会从藻体释放。本实验通过荧光定量分析发现,PyMFG在不放散单孢子的坛紫菜(WT-8)中不表达,在大量放散单孢子的圆紫菜(PS-WT)、印度产紫菜(PC-WT)以及条斑紫菜(W')中表达且种间的表达量差异显著,充分说明该基因与单孢子的形成密切相关。

    单孢子放散实验发现,W品系不放散单孢子,RW'R'品系能够大量放散单孢子且放散总量差异显著。此外,PyMFG基因在父本品系(W)中不表达,与单孢子放散实验结果相符。在偏父本品系(W')中的相对表达量随藻体日龄的增长日趋增大,放散能力增强,与单孢子放散实验结果相符。然而,该基因在母本品系(R)与偏母本品系(R')中的相对表达量变化与二者大量放散单孢子的性状存在差异。推测两品系单孢子形成和放散的基因与父本品系(W)和偏父本品系(W')存在本质性差异,而这与其杂交母本(fre-1)发生的点突变息息相关。

    大量放散单孢子的条斑紫菜红色突变体(fre-1)是由野生型条斑紫菜(U-511)经化学诱变剂甲基硝基亚硝基胍诱变而来[2]。化学诱变导致多种点突变位点产生,从而使诱变品系(fre-1)获得大量与单孢子形成和放散相关的基因,进而促进自身单孢子的形成和大量放散。然而,基因是有遗传效应的DNA片段,且遗传重组主要发生在染色体的四分体时期。由此推测,大量放散单孢子的条斑紫菜红色突变体(fre-1,母本)与野生型条斑紫菜(U-511,父本)杂交时,仅重组少量相关基因片段和基因种类给父本品系(U-511),从而使重组的偏父本品系(W')具有大量放散单孢子的性状。然而,母本品系(R)和偏母本品系(R')则保留了大量不同于父本品系的单孢子形成和放散的基因,这些基因可能是参与单孢子形成的上游调控元件基因、关键形成基因以及参与其放散的细胞壁分解酶基因。更重要的是,该部分基因可能与偏父本品系中的PyMFG基因在调控单孢子形成和放散时的相互作用网络存在差异。由此推测,此性状的发生至少由1对等位基因控制。

结论
  • 不同紫菜种间的荧光定量PCR实验证实了PyMFG基因与紫菜属的某些红藻形成和放散单孢子的性状密切相关。此外,本研究根据单孢子放散实验和荧光定量PCR实验,推断出大量放散单孢子的条斑紫菜品系中存在大量调控单孢子形成和放散的基因,至少有1对等位基因参与调控其形成和放散,从而使上述结果存在差异。此外,条斑紫菜的PyMFG蛋白含有TEA结合结构域,与构巢曲霉和黑曲霉的分生孢子形成蛋白AbaA属近缘同源蛋白,可能作为转录调控因子调节其单孢子的形成,为后期研究条斑紫菜单孢子形成和放散的分子生物学机制提供了方向,进而为开展条斑紫菜在工程菌中的表达研究和开发合理放散单孢子的紫菜新品种提供了理论支持。然而,以上实验结果仅为推断与预测,PyMFG基因具体的分子生物学功能还需通过实验进一步验证。

Reference (34)

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